血清脂蛋白的離心機分離技術(shù)
血清脂蛋白是由血液中脂質(zhì)與某些特異的蛋白質(zhì)組成的一類不均一的復(fù)合物。
因其所含脂與載脂蛋白的比例不同,其密度范圍在0.96g/ml或更低至1.21g/ml之間。
紙電泳中顯示四條帶即:乳密顆粒,極低密度脂蛋白,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白。每種脂蛋白還可以分為更多的亞組分。
用電泳法分離含載脂蛋白較高的組份(HDL,VHDL)比較成功,而離心分離法則適合用于各種密度的血清脂蛋白分離。
一、梯度材料:
血清脂蛋白密度較低,常用的梯度材料為Nacl,NaI,Kbr,KI等,常用的緩沖劑為ED。
表一 常用梯度材料的配置及密度(20°C)
名稱 配置 密度(g/ml)
Nacl 0.196M 1.006
NaBr 0.804M 1.063
NaBr 2.705M 1.21
KBr 0.747M 1.063
KBr 1.496M 1.21
NaCl+KBr+EDTA 153gNaCl+354gKBr+10ml
0. 2MEDTA+水至總量1000ml 1.35
NaCl,NaBr
A液:200gNaCl+800ml水
B 液:400gNaBr+600ml水
C液11.14gNaCl+788.6ml水(ρ=1.006gml) 10ml A液+31.7mlB液
10ml A液+15.6mlB液
10ml C液+2ml 1.35液
4ml C液+6ml 1.35液 1.35
1.31
1.063
1.21
二、預(yù)分離:
1、血細胞與血清分離:
離心參數(shù):全血,角轉(zhuǎn)頭,3,000rpm×20min
結(jié)果:沉淀為血細胞,上部為血清。
2、乳糜粒分離:禁食12小時以上人血漿中乳糜粒含量極少,已進食者因其血漿含乳糜粒高,應(yīng)先離心去除乳糜粒。
離心參數(shù):4 ×10 (g×min),10°C.各種轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速均可。
梯度液配置:離心管下部3/4容積加血漿,上部1/4容積加0。
5MnaCl+0.3MEDTA,ph7.4
結(jié)果:乳糜粒上浮,吸出。
3、血清蛋白分離:除去球蛋白,白蛋白及其它蛋白質(zhì)。
離心參數(shù):(2。5-3)×10 (g× hr), 各種轉(zhuǎn)頭均可。如角轉(zhuǎn)頭70,000rpm× 6hrs,10°C
配置:管容量1/3為血清,2/3為1。31g/ml,NaCl+NaBr,攪拌后終密度為1。21g/ml
結(jié)果:管上部1/6容積為血清脂蛋白,下部5/6為其它蛋白。
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